Меню
Главная
Авторизация/Регистрация
 
Главная arrow Сельское хозяйство arrow Молекулярно-генетическая идентификация аллелей S2 и S10 гена самонесовместимости у кребов и элитных селекционных форм яблони

Молекулярно-генетическая идентификация аллелей S2 и S10 гена самонесовместимости у кребов и элитных селекционных форм яблони


На современном этапе развития методов генетики широкое применение нашли методы ДНК-маркирования, которые основаны на анализе полиморфизма генома. ДНК-маркеры широко используются при изучении генофонда культурных растений: для оценки генетических взаимосвязей изучаемых образцов в коллекциях генетических ресурсов; для ДНК-паспортизации сортов; картирования генов и их отслеживания в селекционном процессе (маркер-опосредованная селекция, позволяющая проводить идентификацию и отбор генотипов, несущих целевые гены, без их оценки по фенотипу) [1]. Необходимо отметить, что ДНК-маркерный отбор может быть наиболее востребованным при оценке признаков, для которых фенотипическая оценка является сложной процедурой или требует временных затрат и зависит от условий окружающей среды.

Для яблони - основной плодовой культуры, высокой актуальностью обладает вопрос, связанный с подбором опылителей и, соответственно, связанным с этим определением совместимости сортов при опылении. От этого напрямую зависит продуктивность садового агроценоза. В системе самонесовместимости яблони основная функция в регуляции принадлежит гену самонесовместимости (S-ген). Продукты S-гена в пестике - цитотоксические протеины с рибонуклеазной активностью (S-РНКазы). В процессе самонесовместимого взаимодействия S-РНКазы контролирует прорастание пыльцевой трубки, проникая в цитоплазму и деградируя пыльцевую РНК [2]. Пыльцевые трубки, прорастающие из пыльцы с определенной аллелью S-гена, ингибируются в пестиках растений, несущих тот же аллель [3]. Следовательно, оплодотворение блокируется, когда S-аллель пыльцы совпадает с одной или двумя S-аллелями пестика. Два сорта, несущие идентичный набор аллелей S-гена являются несовместимыми. При взаимоопылении таких сортов оплодотворения и последующего формирования плодов не происходит. Сорта, частично совместимые, несут по одной одинаковой S-аллели. Они могут являться опылителями друг для друга, однако эффективность опыления при этом снизится на уровень около 50% [2]. Необходимо сказать, что данный уровень снижения будет обусловлен исключительно генотипом сорта, при воздействии дополнительных факторов (расхождения в сроках цветения, низкая жизнеспособность пыльцы сорта-опылителя, неблагоприятные погодные условия) уровень закладки плодов снизится еще значительнее. Очевидно, что для максимальной реализации потенциала продуктивности сортов яблони необходимо выполнять формирование сортовых схем садового насаждения с учетом совместимости при опылении - использовать наиболее эффективных опылителей или комбинации сортов с наибольшим уровнем совместимости. В этой связи, важным этапом является определение аллельного набора S-гена у сортов.

Одним из перспективных путей получения максимального уровня опыления в садовом агроценозе является использование так называемых кребов яблони - сортов и форм, представляющих, как правило, образцы видов рода Malus или их межвидовые гибриды с яблоней домашней (Malus domestica Borch). Ряд кребов уже зарекомендовали себя в качестве перспективных опылителей для создания моносортных насаждений промышленных сортов, однако, учитывая разнообразие данных сортов и форм и постоянное пополнения промышленного сортимента яблони новыми сортами, следует отметить важность знаний об аллельном составе S-гена у кребов. Это позволит рекомендовать наиболее перспективные среди них для сортов яблони.

Очевидно, что применение ДНК-маркеров для экспресс идентификации аллельных комбинаций данного гена обладает значительным преимуществом в сравнении с фенотипической оценкой совместимости, так как может быть выполнено в сжатые сроки. На настоящее время молекулярно-генетический контроль данного процесса глубоко изучен, известно порядка 25 аллелей S-гена. Однако в культурном мировом генофонде яблони наиболее распространены 7-8 основных аллелей, из которых аллели S2, S3, S5, S7, S10 являются наиболее распространенными [4, 5].

Использование ДНК-маркеров определило возможность идентификации аллелей гена самонесовместимости среди образцов коллекций генетических ресурсов яблони в различных странах, где возделывается данная культура [6]. В отечественных генетических исследованиях яблони также получены результаты об аллельных комбинация искомого гена у сортов российской селекции, а также перспективных селекционных форм (элитных форм) [7 - 10].

Важность этих исследований очевидна - появляется возможность прогнозировать степень совместимости сортов при опылении, что позволяет эффективно комбинировать сорта в садовом насаждении, размещая максимально совместимые сорта в саду в непосредственной близости. Это позволит получать наибольший уровень завязи плодов и, соответственно, урожайности, а также создавать моносортные насаждения, экономя затраты на проведение защитных мероприятий и уборку плодов. Наряду с этим, данные об аллельном составе гена самонесовместимости могут являться частью ДНК-паспортов сортов яблони в комплексе с микросателлитным ДНК-фингерпринтом.

В связи с вышесказанным, в задачи наших исследований входило выполнение ДНК - маркерной идентификации аллельных комбинаций гена самонесовместимости у сортов и форм кребов. На данном этапе работы целевыми являлись аллели S2 и S10, относящиеся к числу наиболее распространенных аллелей в мировом сортименте яблони.

Материал и методы исследований

Объектами исследования послужили кребы и элитные селекционные формы яблони. ДНК экстрагировали методом ЦТАБ [11]. Для идентификации аллелей гена самонесовместимости использовали метод полимеразной цепной реакции ПЦР, согласно общепринятым рекомендациям [12] с праймерами, фланкирующими маркерные участки аллелей S2 и S10 гена самонесовместимости [4]. Использовали следующие концентрации компонентов реакционной среды: В состав ПЦР смеси входили: 40-50 нг ДНК, 0,05мМ dNTPs, 0,3мкM каждого праймера, 1 единица активности (е.а.) Taq-ДНК полимеразы, в общем объеме реакционной смеси 25мкл. Постановку ПЦР осуществляли по следующей программе: 5 минут при 94о С - начальная денатурация; следующие 35 циклов: 30 секунд денатурация при 94о С, 40 секунд отжиг праймеров при 60о С, 30 секунд элонгация при 72о С; последний цикл элонгации 5 минут при 72о С.

Электрофорез продуктов ПЦР проводили в 2% агарозном геле, на основе трис боратного буфера при напряжении 150 V в течение 30 минут. Гелевые пластины окрашивали бромистым этидием и визуализировали в ультрафиолете.

Результаты

Получены результаты молекулярно-генетической идентификации целевых аллелей гена самонесовместимости для 27 кребов и 2 элитных селекционных форм яблони. В изученной выборке образцов идентифицировали обе целевые аллели. На рисунках 1 и 2 представлены результаты ПЦР идентификации данных аллелей у изучаемых образцов.

Рисунок 1 - Идентификация аллели S2 у образцов яблони

Примечания: М-маркер молекулярной массы ДНК; К+ - сорт контроль Гала; 1-8- исследуемые образцы яблони: 1- Спартак,

2 - Китайка № 3, 3 - 2-66-10, 4 - Транс Люценс, 5 - Империал Павла,

6 - Пиотош, 7 - Эксцельзиор, 8 - Желтогибридное

Рисунок 2 - Идентификация аллели S10 у образцов яблони

Примечания: М-маркер молекулярной массы ДНК; К+ - сорт контроль Мекинтош; 1-8 - исследуемые образцы яблони: 1- Желтое румяное, 2- Темно-вишневое, 3- Креб 2-71, 4- 12/1-20-34, 5- 12/2-20(24-28), 6- Геспер Роз, 7- Фейри

Выявление фрагмента на электрофореграмме на уровне, отмеченном стрелкой, соответствующем стандартному образцу, свидетельствует о наличии искомого аллеля гена самонесовместимости, отсутствие фрагмента - об отсутствии аллеля. В ходе исследования идентифицировали все целевые аллели, однако, с разной частотой встречаемости. Наиболее редким оказался аллель S10, который был выявлен у одного образца - элитной формы 12/1-20-34. Результаты генотипирования изученной выборки генотипов яблони по локусу S-гена представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Идентификация аллелей S-гена у образцов яблони

№ п/п

Сорт

S2

S10

1

Пестрокрасное

-

-

2

Красно-вишневое

-

-

3

Краснополосатое

-

-

4

Креб 67-2

+

-

5

Китайка малиновая

-

-

6

Рислинг красный

-

-

7

Виктория

-

-

8

Кетни

-

-

9

Джон Дауни

-

-

10

Долго

+

-

11

Спартак

+

-

12

Китайка № 3

+

-

13

Креб 2-66-10

+

-

14

Транс Люценс

+

-

15

Империал Павла

-

-

16

Пиотош

+

-

17

Эксцельзиор

+

-

18

Желтогибридное

+

-

19

Желтое румяное

+

-

20

Темно-вишневое

+

-

21

Креб 2-71

+

-

22

12/1-20-34

-

+

23

12/2-20(24-28)

+

-

24

Геспер Роз

+

-

25

Фейри

-

-

26

Желто-зеленое

-

-

27

Никита

-

-

28

Гертруда

-

-

29

Экселенц Тиль

-

-

Как видно из таблицы аллели идентифицируются со значительной разницей в частоте встречаемости. Если аллель S2 идентифицировался у 14 образцов (13 кребов и 1 элитной селекционной формы), то аллель S10 - лишь у одного образца (элитной формы 12/2-20(24-28). Примечательно, что аллель S10, относится к наиболее распространенным в мировом генофонде яблони, однако в изученной выборке образцов яблони он не распространен. Видно, что у кребов не идентифицируются одновременно два аллеля из представленных. В случае одновременного наличия у них двух изученных аллелей, которые являются наиболее распространенными, существенно возросла бы вероятность совпадения аллельного набора у креба и того промышленного сорта, для которого он предлагается как опылитель. На данном этапе работы, можно сделать заключение о том, что кребы Пестрокрасное, Красно-вишневое, Краснополосатое, Китайка малиновая, Рислинг красный, Виктория, Кетни, Джон Дауни, Империал Павла, Фейри, Желтозеленое, Никита, Гертруда и Экселенц Тиль можно рекомендовать, как более перспективные опылители из изученной выборки, так как у них не были выявлены аллели S2 и S10, которые относятся к числу наиболее распространенных в мировом генофонде яблони. Однако, необходимо сказать также и о целесообразности дальнейшего проведения молекулярно-генетической идентификации таких распространенных аллелей как S3, S5, S7, S1. Это даст возможность более обоснованно дать рекомендации по использованию изученных кребов в качестве опылителей для сортов, наиболее распространенных в промышленном садоводстве.

Литература

1 Хавкин Э.Е. Молекулярные маркеры в растениеводстве / Э.Е. Хавкин // Сельскохозяйственная биология. - 1997.- № 5.- С.3-19.

2 Суриков И. М. Несовместимость и эмбриональная стерильность растений. М.

1991. - 220 с.

3 Broothaerts W. cDNA cloning and molecular analysis of two self-incompatibility alleles from apple / W. Broothaerts, G. Janssens, P. Proost et al. // Plant Mol Biol. - V. 27. - 1995. -- P. 449-511.

4 Janssens G. A. A molecular method for S-allele identification in apple based on allele-specific PCR / G.A. Janssens, I.J. Goderis, W.F. Broekaert et al. // Theor. Appl. Genet. - 1995. - V. 91. - P. 691-698.

5 Broothaerts W. New findings in apple S-genotype analysis resolve previous confusion and request the re-numbering of some S-alleles // Theor Appl Genet. - V.106. _ 2003. - P. 703-714

6 Hegedыs A. Review of the self-incompatibility in apple (MalusЧdomestica Borkh., syn.: Malus pumila Mill.) // International Journal of Horticultural Science. V. 12. - 2006. - P. 31-36.

7 Супрун И. И. Молекулярно-генетическая идентификация аллелей гена самонесовместимости у сортов яблони отечественной селекции / И. И. Супрун, Е. В. Ульяновская, Я. В. Ушакова, Е. Т. Ильницкая // Доклады РАСХН. - 2011. - №5. - С. 15-17.

8 Супрун И. И. Использование методов ДНК-маркирования для идентификации аллелей гена самонесовместимости яблони // И. И. Супрун, Е. В. Ульяновская, Я. В. Ушакова / Труды Кубанского государственного университета. - №1(22), 2010. - с. 57-59.

9 Супрун И. И. Цитолого-генетическое изучение особенностей опыления иммунных и высокоустойчивых к парше сортов яблони // И. И. Супрун, Е. В. Ульяновская, Я. В. Ушакова / Агро ХХI. - №1-3, 2010. - с. 27-28.

10 Супрун И.И., Ульяновская Е.В. Изучение аллельного полиморфизма гена самонесовместимости и цитологических особенностей опыления сортов яблони // Плодоводство и виноградарство Юга России [Электронный ресурс] 2012. № 13 (01). URL: http://journal.kubansad.ru/pdf/12/01/02.pdf.

11 Murray, M. G. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA / M. G. Murray, W. F. Thompson // Nucleic Acids Research, 1980.-V. 10.- Р. 4321-4325.

12 Шибата, Д.К. Полимеразная цепная реакция и молекулярно-генетический анализ биоптатов // Молекулярная клиническая диагностика. - М.: Мир, 1999. - С. 395-427.

 
Если Вы заметили ошибку в тексте выделите слово и нажмите Shift + Enter
 
Предметы
Банковское дело
Бухучет и аудит
География
Журналистика
Информатика
История
Культурология
Литература
Маркетинг
Математика, химия, физика
Медицина
Менеджмент
Недвижимость
Охрана труда
Педагогика
Политология
Право
Психология
Религиоведение
Сельское хозяйство
Социология
Спорт
Техника
Товароведение
Философия
Финансы
Экология
Экономика
Этика и эстетика
Прочее